Der Ausbruch des Krieges am 1. September 1939 griff direkt in die wissenschaftliche Laufbahn Heisenbergs ein. Er wurde einberufen, aber zu seiner Überraschung nicht an die Front, sondern ins Heereswaffenamt nach Berlin. Dort wurde ihm und anderen führenden Atomphysikern Deutschlands – die den sogenannten Uranverein bildeten – die Aufgabe gestellt, zu untersuchen, ob die von Otto Hahn und Fritz Strassmann im Jahre 1938 entdeckte Uranspaltung in großtechnischem Maßstabe, etwa zum Bau einer energieerzeugenden Maschine, herangezogen werden könne. Innerhalb von zwei Monaten verfaßte Heisenberg einen umfangreichen Bericht, in dem er die Theorie einer Kettenreaktion der Uranspaltung durch Neutronen entwickelte (6. Dezember 1939); bald darauf baute er die Theorie unter Zuhilfenahme der neuesten verbesserten Meßergebnisse im Detail aus (Bericht vom 29. Februar 1940).
Das Heereswaffenamt bestimmte das Kaiser-Wilhelm-Institut für Physik in Berlin-Dahlem zum Zentrum der Uranforschung. Der Direktor dieses Institutes Peter Debye durfte als Holländer an den geheimen Forschungsarbeiten nicht teilnehmen; er nahm Urlaub und ging im Januar 1940 als Gastprofessor für Chemie an die Cornell-Universität. Kurt Diebner vom Heereswaffenamt bezog Debyes Büro als Leiter des Berliner Uranprojektes. Auf Vorschlag von C. F. von Weizsäcker und besonders Karl Wirtz, die beide Mitarbeiter von Debye gewesen waren und nun am Uranprojekt teilnahmen, wurde Heisenberg als wissenschaftlicher Berater des Berliner Instituts herangezogen. Er reiste daher allwöchentlich einmal von Leipzig nach Berlin und schrieb einige Berichte über den Fortgang der Berliner Arbeiten (Dezember 1940 bis Februar 1942). Am Kaiser-Wilhelm-Institut gingen gleichzeitig andere, nicht geheime Forschungsarbeiten, die bereits unter Debyes Leitung begonnen worden waren, etwa über Röntgenstrukturanalyse, über Kern- und Tieftemperaturphysik, unter der Aufsicht des stellvertretenden Direktors Max von Laue weiter. In den Jahren 1941 und 1942 leitete Heisenberg auch ein Seminar am Kaiser-Wilhelm-Institut, in dem er Mitgliedern des Instituts und Gästen über den neuesten Stand der Forschung über kosmische Strahlung berichtete. Diese Vorträge wurden 1943 in dem Arnold Sommerfeld zum 75. Geburtstag gewidmeten Buch „Kosmische Strahlung" veröffentlicht.
Im Frühjahr 1940 begann Heisenberg mit Robert und Klara Döpel Experimente an der Universität Leipzig durchzuführen. Sie untersuchten mögliche Anordnungen von Uran und Neutronen bremsenden Substanzen, da für die Kernspaltung sich langsame Neutronen als am wirkungsvollsten erwiesen hatten. Diese Experimente bestätigten vor allem die Brauchbarkeit von schwerem Wasser als Moderator (28. Oktober 1941) und zeigten Anfang 1942, daß eine kugelförmige Anordnung von Schichten aus natürlichem Uran und schwerem Wasser zu einer geringfügigen Vermehrung der eingestrahlten Neutronen führte (bestätigt im Juni 1942).
Damit waren die Vorbedingungen zu einem funktionierenden Kernreaktor erfüllt. Am 4. Juni 1942 fand ein Treffen statt, an dem der Reichsminister für Bewaffnung und Munition, Albert Speer, einige seiner Beamten, hohe Militärs und die Wissenschaftler des Uranprojektes, darunter O. Hahn, W. Heisenberg, K. Diebner, P. Harteck und K. Wirtz, teilnahmen. Es wurde entschieden, daß das Projekt fortgesetzt werden sollte mit dem Ziel, einen energieerzeugenden Reaktor (Uranmaschine) zu bauen, nicht aber eine Atombombe. Die Anreicherung von U-235 - die für eine Bombe notwendig gewesen wäre - wurde nicht geplant. Als Ergebnis dieser Entscheidung gab das Heereswaffenamt das Kaiser-Wilhelm-Institut für Physik wieder vollständig der Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft zurück; allerdings blieben die in ihm betriebenen Uranarbeiten geheim. Heisenberg, der seit 1940 wissenschaftlicher Hauptberater in Berlin und Mitarbeiter (auch theoretischer Leiter) des erfolgreichen Leipziger Experimentes gewesen war, wurde zum Leiter der wichtigsten Uranforschungsgruppe in Deutschland ernannt. Gleichzeitig bestellte ihn die Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft zum Direktor am Institut (in Vertretung für den beurlaubten Debye). Er übernahm viele von Debyes früheren Assistenten, darunter Horst Korsching und Karl Wirtz, aber auch neue Mitarbeiter wie Erich Bagge und Fritz Bopp. Kurt Diebner, der vorherige Leiter des Berliner Projektes, ging mit einigen Mitarbeitern an das Heereslaboratorium in Gottow, wo er seine eigenen Uranexperimente aufbaute; C. F. von Weizsäcker nahm die Professur für theoretische Physik an der Universität Straßburg an.
Die Arbeit am Uranprojekt füllte Heisenbergs Arbeitskraft in den Kriegsjahren keineswegs vollständig aus. Er beschäftigte sich weiterhin mit Problemen der kosmischen Strahlung und schlug eine neue Theorie der Elementarteilchen auf der Grundlage des Begriffes der Streumatrix vor. Drei Arbeiten, die er im September und Oktober 1942 und im Mai 1944 einreichte, erschienen in der Zeitschrift für Physik. Er hielt außerdem als Ordinarius für theoretische Physik reguläre Vorlesungen an den Universitäten von Leipzig und (ab Sommer 1942) Berlin über verschiedene Gebiete. Zudem reiste er ins Ausland, soweit es die Kriegsbedingungen zuließen, u. a. nach Budapest im April 1941, nach Preßburg im März 1943, nach Zürich, Bern und Basel im November 1942, nach Utrecht und Leiden im Oktober 1943 und nach Kopenhagen im April 1944. Auf diesen Reisen traf er Kollegen und sprach mit ihnen über die Ergebnisse seiner nichtgeheimen Forschung, ebenso wie über allgemeinere Fragen der theoretischen Physik und der Wissenschaft. Einen besonderen Zweck verfolgte ein Besuch in Kopenhagen bei Niels Bohr, der im Oktober 1941 stattfand. Ohne das Geheimnis seiner Arbeit am deutschen Uranprojekt preiszugeben, versuchte Heisenberg Bohr mitzuteilen, daß in Deutschland der Bau einer Atombombe nicht beabsichtigt war. Der Mißerfolg dieses Besuches warf einen tiefen Schatten auf die späteren Beziehungen zwischen Heisenberg und seinem Lehrer und Freund.
Während Enrico Fermi in Chicago schon 1942 in seinem Uran-Graphit-Reaktor eine kritische Kettenreaktion beobachten konnte, gestaltete sich der weitere Fortgang in Deutschland als außerordentlich schwierig. Zwar waren die hauptsächlichen wissenschaftlichen und technischen Fragen auch in Deutschland gelöst worden (siehe Heisenbergs Berichte vom 26. Februar und 23. Juli 1942), und es blieb nur noch die Aufgabe übrig, genug Uran und schweres Wasser in einer geeigneten Anordnung zu sammeln, um einen energieerzeugenden Reaktor zum Gehen zu bringen. Die Kriegsbedingungen beeinträchtigten jedoch den Fortschritt ganz erheblich. In Deutschland gab es kaum ausreichend Uran und vor allem zu wenig schweres Wasser, ein Mangel, der verstärkt wurde durch die Tatsache, daß drei Gruppen konkurrierende Experimente betrieben; neben Berlin eine Hamburger Gruppe unter Paul Harteck und die Gottower Gruppe Kurt Diebners. Die sich verschärfenden Luftangriffe auf Berlin erzwangen zunächst die Verlegung der Apparatur in einen Bunker auf dem Dahlemer Institutsgelände; schließlich verlagerte man Ende 1944 das gesamte Projekt in einen Felsenkeller unter der Schloßkirche von Haigerloch in Südwestdeutschland. Das Kaiser-Wilhelm-Institut für Physik war bereits 1943 in die nahegelegene Stadt Hechingen übersiedelt. Anfang 1945 erreichte der Modellreaktor B8 in Haigerloch nahezu den kritischen Punkt, d. h. den Zustand, in dem eine sich selbst unterhaltende Reaktion eintritt. Nur das Fehlen von einigen hundert Kilogramm Uran und schweren Wassers verhinderte den Erfolg vor Kriegsende.
Ende April 1945 erreichten Mitglieder einer amerikanischen Sondereinheit der Alsos-Mission unter der Führung von Colonel Boris T. Pash und dem Physiker Samuel A. Goudsmit kurz vor den vorrückenden französischen Truppen Hechingen und Haigerloch. Die dort versammelten deutschen Wissenschaftler – Bagge, Korsching, von Laue, von Weizsäcker und Wirtz – wurden wie vorher Hahn in Tailfingen gefangengenommen. Heisenberg war einige Tage vorher mit dem Fahrrad nach Urfeld zu seiner Familie aufgebrochen. Er wurde dort am 3. Mai 1945 von einer kleinen Einheit der Alsos Mission unter der Führung von Colonel Boris T. Pash gefaßt und nach Heidelberg gebracht. Hinzu kamen in Paris Walther Gerlach (Reichsbeauftragter für das Uranprojekt), Diebner und Harteck. Alle zehn Wissenschaftler wurden schließlich in England interniert. Die Amerikaner bauten den Haigerlocher Reaktor ab und brachten die gesamte Apparatur mit vorgefundenem Uran, dem schweren Wasser und zahlreichen Unterlagen in die Vereinigten Staaten.
Das Heereswaffenamt bestimmte das Kaiser-Wilhelm-Institut für Physik in Berlin-Dahlem zum Zentrum der Uranforschung. Der Direktor dieses Institutes Peter Debye durfte als Holländer an den geheimen Forschungsarbeiten nicht teilnehmen; er nahm Urlaub und ging im Januar 1940 als Gastprofessor für Chemie an die Cornell-Universität. Kurt Diebner vom Heereswaffenamt bezog Debyes Büro als Leiter des Berliner Uranprojektes. Auf Vorschlag von C. F. von Weizsäcker und besonders Karl Wirtz, die beide Mitarbeiter von Debye gewesen waren und nun am Uranprojekt teilnahmen, wurde Heisenberg als wissenschaftlicher Berater des Berliner Instituts herangezogen. Er reiste daher allwöchentlich einmal von Leipzig nach Berlin und schrieb einige Berichte über den Fortgang der Berliner Arbeiten (Dezember 1940 bis Februar 1942). Am Kaiser-Wilhelm-Institut gingen gleichzeitig andere, nicht geheime Forschungsarbeiten, die bereits unter Debyes Leitung begonnen worden waren, etwa über Röntgenstrukturanalyse, über Kern- und Tieftemperaturphysik, unter der Aufsicht des stellvertretenden Direktors Max von Laue weiter. In den Jahren 1941 und 1942 leitete Heisenberg auch ein Seminar am Kaiser-Wilhelm-Institut, in dem er Mitgliedern des Instituts und Gästen über den neuesten Stand der Forschung über kosmische Strahlung berichtete. Diese Vorträge wurden 1943 in dem Arnold Sommerfeld zum 75. Geburtstag gewidmeten Buch „Kosmische Strahlung" veröffentlicht.
Im Frühjahr 1940 begann Heisenberg mit Robert und Klara Döpel Experimente an der Universität Leipzig durchzuführen. Sie untersuchten mögliche Anordnungen von Uran und Neutronen bremsenden Substanzen, da für die Kernspaltung sich langsame Neutronen als am wirkungsvollsten erwiesen hatten. Diese Experimente bestätigten vor allem die Brauchbarkeit von schwerem Wasser als Moderator (28. Oktober 1941) und zeigten Anfang 1942, daß eine kugelförmige Anordnung von Schichten aus natürlichem Uran und schwerem Wasser zu einer geringfügigen Vermehrung der eingestrahlten Neutronen führte (bestätigt im Juni 1942).
Damit waren die Vorbedingungen zu einem funktionierenden Kernreaktor erfüllt. Am 4. Juni 1942 fand ein Treffen statt, an dem der Reichsminister für Bewaffnung und Munition, Albert Speer, einige seiner Beamten, hohe Militärs und die Wissenschaftler des Uranprojektes, darunter O. Hahn, W. Heisenberg, K. Diebner, P. Harteck und K. Wirtz, teilnahmen. Es wurde entschieden, daß das Projekt fortgesetzt werden sollte mit dem Ziel, einen energieerzeugenden Reaktor (Uranmaschine) zu bauen, nicht aber eine Atombombe. Die Anreicherung von U-235 - die für eine Bombe notwendig gewesen wäre - wurde nicht geplant. Als Ergebnis dieser Entscheidung gab das Heereswaffenamt das Kaiser-Wilhelm-Institut für Physik wieder vollständig der Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft zurück; allerdings blieben die in ihm betriebenen Uranarbeiten geheim. Heisenberg, der seit 1940 wissenschaftlicher Hauptberater in Berlin und Mitarbeiter (auch theoretischer Leiter) des erfolgreichen Leipziger Experimentes gewesen war, wurde zum Leiter der wichtigsten Uranforschungsgruppe in Deutschland ernannt. Gleichzeitig bestellte ihn die Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft zum Direktor am Institut (in Vertretung für den beurlaubten Debye). Er übernahm viele von Debyes früheren Assistenten, darunter Horst Korsching und Karl Wirtz, aber auch neue Mitarbeiter wie Erich Bagge und Fritz Bopp. Kurt Diebner, der vorherige Leiter des Berliner Projektes, ging mit einigen Mitarbeitern an das Heereslaboratorium in Gottow, wo er seine eigenen Uranexperimente aufbaute; C. F. von Weizsäcker nahm die Professur für theoretische Physik an der Universität Straßburg an.
Die Arbeit am Uranprojekt füllte Heisenbergs Arbeitskraft in den Kriegsjahren keineswegs vollständig aus. Er beschäftigte sich weiterhin mit Problemen der kosmischen Strahlung und schlug eine neue Theorie der Elementarteilchen auf der Grundlage des Begriffes der Streumatrix vor. Drei Arbeiten, die er im September und Oktober 1942 und im Mai 1944 einreichte, erschienen in der Zeitschrift für Physik. Er hielt außerdem als Ordinarius für theoretische Physik reguläre Vorlesungen an den Universitäten von Leipzig und (ab Sommer 1942) Berlin über verschiedene Gebiete. Zudem reiste er ins Ausland, soweit es die Kriegsbedingungen zuließen, u. a. nach Budapest im April 1941, nach Preßburg im März 1943, nach Zürich, Bern und Basel im November 1942, nach Utrecht und Leiden im Oktober 1943 und nach Kopenhagen im April 1944. Auf diesen Reisen traf er Kollegen und sprach mit ihnen über die Ergebnisse seiner nichtgeheimen Forschung, ebenso wie über allgemeinere Fragen der theoretischen Physik und der Wissenschaft. Einen besonderen Zweck verfolgte ein Besuch in Kopenhagen bei Niels Bohr, der im Oktober 1941 stattfand. Ohne das Geheimnis seiner Arbeit am deutschen Uranprojekt preiszugeben, versuchte Heisenberg Bohr mitzuteilen, daß in Deutschland der Bau einer Atombombe nicht beabsichtigt war. Der Mißerfolg dieses Besuches warf einen tiefen Schatten auf die späteren Beziehungen zwischen Heisenberg und seinem Lehrer und Freund.
Während Enrico Fermi in Chicago schon 1942 in seinem Uran-Graphit-Reaktor eine kritische Kettenreaktion beobachten konnte, gestaltete sich der weitere Fortgang in Deutschland als außerordentlich schwierig. Zwar waren die hauptsächlichen wissenschaftlichen und technischen Fragen auch in Deutschland gelöst worden (siehe Heisenbergs Berichte vom 26. Februar und 23. Juli 1942), und es blieb nur noch die Aufgabe übrig, genug Uran und schweres Wasser in einer geeigneten Anordnung zu sammeln, um einen energieerzeugenden Reaktor zum Gehen zu bringen. Die Kriegsbedingungen beeinträchtigten jedoch den Fortschritt ganz erheblich. In Deutschland gab es kaum ausreichend Uran und vor allem zu wenig schweres Wasser, ein Mangel, der verstärkt wurde durch die Tatsache, daß drei Gruppen konkurrierende Experimente betrieben; neben Berlin eine Hamburger Gruppe unter Paul Harteck und die Gottower Gruppe Kurt Diebners. Die sich verschärfenden Luftangriffe auf Berlin erzwangen zunächst die Verlegung der Apparatur in einen Bunker auf dem Dahlemer Institutsgelände; schließlich verlagerte man Ende 1944 das gesamte Projekt in einen Felsenkeller unter der Schloßkirche von Haigerloch in Südwestdeutschland. Das Kaiser-Wilhelm-Institut für Physik war bereits 1943 in die nahegelegene Stadt Hechingen übersiedelt. Anfang 1945 erreichte der Modellreaktor B8 in Haigerloch nahezu den kritischen Punkt, d. h. den Zustand, in dem eine sich selbst unterhaltende Reaktion eintritt. Nur das Fehlen von einigen hundert Kilogramm Uran und schweren Wassers verhinderte den Erfolg vor Kriegsende.
Ende April 1945 erreichten Mitglieder einer amerikanischen Sondereinheit der Alsos-Mission unter der Führung von Colonel Boris T. Pash und dem Physiker Samuel A. Goudsmit kurz vor den vorrückenden französischen Truppen Hechingen und Haigerloch. Die dort versammelten deutschen Wissenschaftler – Bagge, Korsching, von Laue, von Weizsäcker und Wirtz – wurden wie vorher Hahn in Tailfingen gefangengenommen. Heisenberg war einige Tage vorher mit dem Fahrrad nach Urfeld zu seiner Familie aufgebrochen. Er wurde dort am 3. Mai 1945 von einer kleinen Einheit der Alsos Mission unter der Führung von Colonel Boris T. Pash gefaßt und nach Heidelberg gebracht. Hinzu kamen in Paris Walther Gerlach (Reichsbeauftragter für das Uranprojekt), Diebner und Harteck. Alle zehn Wissenschaftler wurden schließlich in England interniert. Die Amerikaner bauten den Haigerlocher Reaktor ab und brachten die gesamte Apparatur mit vorgefundenem Uran, dem schweren Wasser und zahlreichen Unterlagen in die Vereinigten Staaten.